jueves, 17 de febrero de 2011

Estudios enzimáticos

1. Hidrólisis enzimática del almidón por la saliva: Acción digestiva de la amilasa salivar.
FUNDAMENTO

  • Lo que ocurre en este proceso es que el lugol se intercala por la molécula de almidón y esto se detecta por la coloración violeta-azulada que toma la mezcla. El almidón es un polisacárido que se encuentra en los amiloplastos de las células vegetales, sobre todo en las semillas, las raíces y los tallos. También aparece en algunos protistas. Realmente esta compuesto por dos tipos de moléculas: la amilosa, siendo ésta a la que se pega el lugol en frío, por lo que es la que se tiñe de azul-violeta; y por la amilopectina. Realmente no se trata de una reacción química sino de una absorción.
  • La saliva contiene una enzima hidrolasa que tiene la función de digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples. Se produce principalmente en las glándulas salivares, se trata de la enzima amilasa. Cuando el almidón es degradado, se obitiene glucosa, dextrosa y fragmentos de otros azucares.
TÉCNICA
  • Primero se hace un tubo patrón con 2ml de una disolución de almidón al 2 % y unas gotas de disolución de yodo (lugol). Observar el resultado. Después se calienta suavemente el tubo hasta que la mezcla pierda el color. Dejar enfriar el tubo bajo el agua del grifo y esperar unos minutos. Anotar lo sucedido.
  • Colocar en un segundo tubo 2ml de la disolución de almidón y una cierta cantidad de saliva, mezclar bien la saliva con la disolución y calentar muy suavemente durante unos segundos. Añadir unas gotas de lugol. Anotar los resultados y dar una explicación a lo ocurrido. 
RESULTADOS OBTENIDOS
  • Al añadirle lugol al almidón pudimos observar como realmente adquiría una coloración azul-violeta por la absorción entre la amilosa y el lugol. Al calentarlo perdía el color ya que la absorción solo se produce en frío. Por tanto cuando luego lo dejamos enfriar, volvió esa coloración características del principio.
  • Al mezclar el almidón con la saliva, la enzima amilasa es la encargada de degradarlo. Si luego le añadimos lugol seguimos observando esa coloración azul-violeta del experimento anterior puesto que se ha vuelto a producir la absorción entre el lugol y la amilosa del almidón.
FUNDAMENTO

                 La catalasa es una enzima que se encuentra tanto en tejidos vegetales (patata, zanahoria, lechuga, ect.) como en tejidos animales (carne, pescado, etc.) produciendo la siguiente reacciñon química:  H2O2 (agua oxigenada) -----> H2O + 1/2O2 (gaseoso). 

              Es decir, la enzima descompone el peróxido de hidrógeno o agua oxigenada en agua y oxígeno gaseoso, que se desprenderá en forma de burbujas en un medio acuoso.

TÉCNICA
  • Poner e varios tubos de ensayo previamente numerados distintos tejidos (más o menos el mismo peso de cada tejido).
  • Añadir 5ml de agua oxigenada a cada tubo y anotar lo que sucede.
  • Explicar lo ocurrido y ordenar los tejidos según su actividad.
  • Repetir el proceso anterior, pero hervir antes los tejidos durante diez minutos. 
  • Exoplicar los resultados obtenidos.

RESULTADOS OBTENIDOS

   Pusimos en 5 tubos de ensayo 21,91 gramos de : zanahoria, hígado, pimiento, habichuelas verdes y apio (cada tejido en un tubo de ensayo).
             Al añadirle peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) observamos que efectivamente burbujeaban todos, unos menos que otros. Esto se debe a que todos esos tejidos contienen la enzima catalasa y al añadirle agua oxigenada se produce la reacción ya citada anteriormente, obteniéndose agua y oxígeno gaseoso que es el responsable de la aparición de esas burbujas, debido a que se desprende de esa menera.
               Según su actividad ordenaremos a los tejidos de nuestro exerimento de mayor a menos actividad:
  • 1- hígado
  • 2- zanahoria
  • 3- pimiento
  • 4- habichuelas verdes
  • 5- apio

3. Actividad catalítica de la catalasa.

FUNDAMENTO/ TÉCNICA

  • En un tubo de ensayo se coloca un trozo de hígado (o 1ml de extracto de hígado) y 10ml de agua oxigenada. Se cierra el tubo con un tapón, que se deja algo flojo para el escape de los gases producidos en la reacción, en cuyo centro exista un orificio por el cual se pueda introducir un termómetro. Así, hemos hecho un calorímetro.
  • Se anota la temperatura ambiente, que se toma como temperatura inicial de la reacción, y después se va anotando las variaciones de temperatura que se producen en el interior del calorímetro cada treinta segundos durante un período de cinco minutos. Hacer la gráfica de la reacción y explicar los resultados.
2. Reconocimiento de la eznima catalasa en tejidos.

Reconocimiento de principios inmediatos en la leche

MATERIALES

- Gradilla con 12 tubos de ensayo           - Pinza de madera para sujetar los tubos
- Espátula metálica                                 - Embudo
- Papel de filtro                                      - Mechero
- Vaso de precipitados                           - Pipeta Pasteur o cuentagotas
- Pipetas graduadas                                - Bombona de agua

PRODUCTOS BIOLÓGICOS Y REACTIVOS

- Leche entera                                        - Leche fermentada de forma natural
- Ácido clorhídrico puro                         - Ácido clorhídrico: solución al 50%
- Ácido nítrico puro                                - Cloruro sódico: solución concentrada
- Hidróxido sódico: solución al 20%       - Reactivo de Benedict o de Fehling
- Sudán III: solución alcohólica al 0,5%

OBJETIVOS

           Se pretende conseguir que el alumnado compruebe de forma sencilla la existencia de diversos principios inmediatos fundamentales como proteínas, grasas y azúcares en un alimento básico como la leche, así como el comportamiento de las proteínas lácteas ante determinados cambios físicos y químicos.

PROCEDIMIENTO

A) Desnaturalización o coagulación de proteínas lácteas.
FUNDAMENTO

Como ya hemos señalado en prácticas anteriores, la coagulación de las proteínas se produce por su desnaturalización, provocada por diversos factores tanto químicos como físicos como: el aumento de temperatura, variaciones de presión y de pH o cambios en la concentración salina. La desnaturalización, cabe recordar, que era la alteración de la conformación nativa de las proteínas por alguno de los factores señalados, provocando la rotura de los enlaces de la estructura cuaternaria, terciaria y secundaria.

TÉCNICA
  • Hacer una serie de cuatro tubos de ensayo y numerarlos.
  • Al tubo nº 1 se le añade 2ml de leche y 2ml de HCl puro.
  • Al tubo nº 2 se le añade igual cantidad de leche y 2ml de una disolución concentrada de NaCl.
  • Al tubo nº 3 añadir 2ml de leche y 2ml de NaOH al 20%.
  • Al tubo nº 4 se le añade 2ml de leche y después se le calienta levemente.

RESULTADOS OBTENIDOS

  •       En el tubo nº 1 podemos observar una fase superior de leche sin coagular, y una fase inferior donde la leche si que se ha coagulado, las proteínas se han precipitado, por tanto en esa fase si se ha producido la desnaturalización.
  • En el tubo nº 2 no se ha producido la desnaturalización de las proteínas lácteas puesto que no se ha coagulado la leche.
  • En el tubo nº 3 ha ocurrido lo mismo que en el tubo nº 1.
  • En el tubo nº 4 tampoco se ha producido la desnaturalización por el hecho de que no se ha coagulado la leche.
B) Reconocimiento de grasas en la leche.
FUNDAMENTO

              Las grasas se colorean de rojo-anaranjado con el colorante Sudán III. Ésto se debe a que el Sudán III es un colorante lipofilo (soluble en grasas). Por esa afinidad a los ácidos grasos hace que la mezcla de éstos con el colorante se ponga de color rojo, mezclándose totalmente y  convirtiéndose en un colorante específico utilizado para revelar la presencia de grasas.

TÉCNICA
  • Colocar 2ml de leche en un tubo de ensayo, añadir 10ml de agua y unas gotas de Sudán III y agitar fuertemente. 
  • Observar que se tiñe todo de rosa. 
  • Añadir 1ml de HCl al 50% y calentarlo. Observar los resultados obtenidos.
RESULTADOS OBTENIDOS
  • a) Fase superior, de color rosa, formada por las grasas teñidas por el Sudán III, que es un colorante específico de grasas como hemos señalado anteriormente.
  • b) Fase intermedia, con el agua y ciertos compuestos solubles, como la lactosa y algunas proteínas disueltas (lactoalbúmina y lactoglobulina).
  • c) Fase inferior, con las proteínas coaguladas y precipitadas (ya señalado antes, se ha producido desnaturalización al calentar la leche).

C) Reconocimiento de glúcidos en la leche.

FUNDAMENTO

          Los monosacáridos y la mayoría de los disacáridos poseen poder reductor, que deben al grupo carbonilo que tienen en su molécula. El poder reductor consiste en la capacidad de un átomo o de un ion de ceder uno o más electrones a otro átomo o ion, que quedará reducido. Este carácter reductor puede ponerse de manifiesto por medio del reactivo de Fehling, a una reacción redox llevada a cabo entre ellos y el sulfato de Cobre (II). Las soluciones de esta sal tienen color azul. Tras la reacción con el glúcido reductor se forma óxido de Cobre (I) de color rojo. De este modo, el cambio de color indica que se ha producido la citada reacción y que, por lo tanto, el glúcido presente es reductor. El hecho de que tengan poder reductor, se debe porque el OH del carbono carbonilo está libre, por lo que reacciona con el sulfato de cobre del Fehling (azul y soluble) reduciéndolo a óxido de cobre (rojo anaranjado y menos soluble). 

TÉCNICA
  • Se recoge aparte con una pipeta Pasteur o cuentagotas la fase soluble de la prueba anteior, se filtra  y se añade 1ml del filtrado a un tubo de ensayo.
  • A este tubo se le agrega 1ml del reactivo de Fehling (o de Benedict) y se le calienta durante unos minutos.
  • Si la prueba es positiva (hay presencia de un glúcido reductor, en este caso la lactosa) aparecerá un precipitado de óxido de cobre, de color rojo.
RESULTADOS OBTENIDOS

       Pese a que lo calentamos durante unos minutos, no observamos el cambio de color, se quedaba azul. Suponemos que se debe a que no lo dejamos el tiempo suficiente.



D) Reconocimiento de proteínas en la leche: Prueba xantoproteica.
FUNDAMENTO
Esta prueba caracteriza a los aminoácidos aromáticos. Estos aminoácidos son esenciales y precursores de otros compuestos biológicos. Nos encontramos con tres tipos: la fenilalanina, tirosina y triptófano. Sus cadenas laterales poseen un anillo aromático. La tirosina es como la fenilalanina pero con un grupo hidroxilo en su anillo aromático, lo que lo hace menos reactivo. 


Esta reacción se debe a la presencia de un grupo fenilo en la molécula proteica. En esta prueba se produce la nitración del anillo bencénico presente en los aminoácidos aromáticos de las proteínas mediante la reacción con el ácido nítrico puro, obteniéndose nitrocompuestos que son los responsables de darle esa coloración amarilla a la mezcla resultante de las proteínas junto el ácido nítrico.

En nuestro experimento utilizaremos la caseína, proteína presente en la leche y que contiene aminoácidos aromáticos.

TÉCNICA

  • Recoger con una espátula el precipitado de la leche coagulada (caseína), llevarlo a un trozo de papel de filtro y secarlo.
  • Poner en un tubo de ensayo una pequeña porción del precipitado seco, añadir unas gotas de ácido nítrico puro y calentar ligeramente.

RESULTADOS OBTENIDOS

              Como pudimos comprobar, cuando al precipitado de la leche coagulada que era la caseína, le añadimos ácido nítrico y lo calentamos vimos como adoptaba una coloración amarilla, debido a, como ya hemos dicho anteriormente, a la nitración de los aminoácidos aromáticos de la caseína.

Reconocimiento de lípidos

RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS

OBJETIVO

 Poner de manifiesto ciertas propiedades de los lípidos, algunas de las cuales nos pueden servir para su identificación.
MATERIALES

-         Tubos de ensayo                      - Solución de NaOH al 20%                 
-         Gradilla                                     - Tinta china roja     
-         Varillas de vidrio                      - Éter, cloroformo o acetona               
-         Mechero                                   - Aceite de oliva
-    Vasos de precipitados              - Solución de Sudán III
-    Pipetas
               
                                                      SAPONIFICACIÓN


      FUNDAMENTO

Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose en los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos. Éstos se combinan con los iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones, que son en consecuencia las sales sódicas o potásicas de los ácidos graso. En los seres vivos, la hidrólisis de los triglicéridos se realiza mediante la acción de enzimas específicos (lipasas) que dan lugar a la formación de ácidos grasos y glicerina.

                A continuación explicaremos en que consiste el proceso de saponificación. Es una reacción química entre un ácido graso (o un lípido saponificable, portador de residuos de ácidos grasos) y una base o alcalino, en la que se obtiene como principal producto la sal de dicho ácido y de dicha base. Es en realidad, una hidrólisis mediante la cual se obtienen los jabones. Los ácidos grasos tienen la particularidad de tener carácter anfipático, es decir tienen una parte polar y otra apolar (o no polar). La parte apolar sería la cadena carbonada, por tanto, insoluble en agua; la parte polar y por tanto soluble en agua sería el extremo donde se encuentra el grupo carboxilo (-COOH). La pequeña parte soluble (hidrófila) se denomina cabeza y la porción larga insoluble (hidrófoba), se llama cola. Gracias a esta característica  pueden interactuar con sustancias de propiedades dispares.

              La saponificación al ser una hidrólisis, es el proceso contrario a la esterificación siendo ésta la síntesis de los lípidos mediante la unión del alcohol y el ácido graso, con la liberación de una molécula de agua. Esa unión es llamada enlace éster.
La reacción de saponificación consiste de forma simplificada:

ÁCIDOS GRASOS + SOLUCIÓN ALCALINA = JABÓN + GLICERINA

           Cabe destacar que en este experimento utilizaremos aceite. Las grasas se presentaran como aceites cuando contengan ácidos grasos insaturados (ácidos carboxílicos de cadena larga con uno o varios dobles enlaces entre los átomos de carbono). 
TÉCNICA
  • Colocar en un tubo de ensayo 2ml de aceite y 2ml de NaOH al 20%.
  • Agitar enérgicamente y colocar el tubo al baño María de 20 a 30 minutos.
  • Pasado este tiempo, se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara que contiene la solución de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra intermedia semisólida que es el jabón formado y una superior lipídica de aceite inalterado.

 RESULTADOS OBTENIDOS

           Como ya hemos citado con anterioridad, observaremos tres fases: la inferior clara con la solución que sobra de hidróxido de sodio (sosa) junto con la glicerina que se ha formado, algo que nos revela que se ha producido la reacción de saponificación perfectamente al haber obtenido un alcohol, y otra fase intermedia semisólida con el jabón formado, otro aspecto que nos aclara definitivamente que si se ha producido esa reacción de saponificación, puesto que ya hemos obtenido los dos productos de ese proceso: el jabón y un alcohol. Observamos también una fase superior lipídica de aceite que no ha participado en la reacción, se encuentra inalterado.
                                                             TINCIÓN

FUNDAMENTO

Los lípidos se colorean selectivamente de rojo-anaranjado con el colorante Sudán III. Ésto es debido a que el Sudán III es un colorante lipofilo (soluble en grasas). Por esa afinidad a los ácidos grasos hace que la mezcla de éstos con el colorante se ponga de color rojo, mezclándose totalmente y  convirtiéndose en un colorante específico utilizado para revelar la presencia de grasas.

TÉCNICA
  • Disponer en una gradilla 2 tubos de ensayo colocando en ambos 2ml de aceite.
  • Añadir a uno de los tubos 4-5 gotas de solución alcohólica de Sudán III.
  • Al otro tubo añadir 4-5 gotas de tinta roja.
  • Agitar ambos tubos y dejar reposar.
  • Observar los resultados: en el tubo con Sudán III todo el aceite tiene que aparecer teñido, mientras que en el tubo con tinta, ésta se irá al fondo y el aceite no estará teñido.

                                                    SOLUBILIDAD

FUNDAMENTO

Los lípidos son insolubles en agua. Esta insolubilidad en agua se debe a que la estructura química básica de los lípidos consiste en cadenas hidrocarbonadas con muchos enlaces C-C y C-H. Estos enlaces no poseen polaridad y no existe interacción con las moléculas de agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequeñísimas gotas formando una emulsión (mezcla de dos líquidos inmiscibles de manera más o menos homogénea) de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo por la reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que, por su menor densidad, se sitúa sobre el agua.
Por el contrario, las grasas son solubles en disolventes orgánicos, como el éter, cloroformo, acetona, benceno, etc, es decir, son solubles en sustancias apolares como ellos.

TÉCNICA
  • Poner 2ml de aceite en dos tubos de ensayo.
  • Añadir a uno de ellos 2ml de agua y al otro 2ml de éter u otro disolvente orgánico.
  • Agitar fuertemente ambos tubos y dejar reposar.
  • Observar los resultados. 
 RESULTADOS OBTENIDOS

 Se verá cómo el aceite se ha disuelto en el éter (disolvente orgánico) y, en cambio no lo hace en el agua al ser insoluble en ella y el aceite subirá debido a su menor densidad, quedándose separados por ser dos líquidos inmiscibles.

CUESTIONES

1.    1.¿Qué son los jabones?

Son lípidos saponificables (es decir, que pueden realizar el proceso de saponificación y son hidrolizables). Son la sal de un ácido graso.
2.    2. ¿Cómo se pueden obtener jabones?
      Mediante el proceso de saponificación, siendo una hidrólisis de un ácido graso que tiene lugar en medio alcalino y se realiza con NaOH o con KOH.
3.    3.  ¿Por qué en la saponificación la glicerina aparece en la fase acuosa?
      Porque en la saponificación, se utilizan grasas y éstas están compuestas por ácidos grasos y glicerina. Como resultado se obtiene una fase semisólida que es la sal de sodio de los ácidos grasos (el jabón), por lo tanto, en la fase acuosa quedará el alcohol (glicerina) como subproducto de la elaboración del jabón puesto que es parcialmente soluble en agua, por lo que no hay razón para que no esté presente en esta forma.
4.    4. ¿Qué enzima logra en el aparato digestivo la hidrólisis de las grasas?
      Concretamente en el estómago la enzima lipasa gástrica y en el intestino delgado la lipasa pancreática-colipasa.
5.    5. Indica lo que ocurre con la mezcla aceite-Sudán III y aceite-tinta y explica a qué se debe la diferencia entre ambos resultados.
     Cuando se mezcla el aceite con el Sudán III, todo el aceite se tiñe de rojo puesto que es un colorante lipofilo (soluble en grasas) y debido a esa afinidad se utiliza para revelar la presencia de grasas. Pero la tinta roja no es soluble en grasas, por esa razón, el aceite no se tiñe de rojo con la tinta china roja puesto que no se mezclan, y la tinta se deposita en el fondo.
6.    6. ¿Qué ocurre con la emulsión de agua en aceite transcurridos unos minutos de reposo? ¿Y con la de benceno y aceite? ¿A qué se deben las diferencias observadas entre ambas emulsiones?
      -    Al pasar unos minutos de reposo, esa emulsión desaparece por la reagrupación de las gotitas de grasa en una capa, que por ser menos densa, se sitúa sobre el agua, de mayor densidad.
-    Aparece una disolución homogénea, puesto que el aceite se disuelve en el benceno, sustancia orgánica y apolar al igual que el aceite.
-    Simplemente por la solubilidad de las grasas: insolubles en agua y por tanto no se mezcla con ella, y solubles en disolventes apolares como él, por eso si se mezclan.

RESULTADOS OBTENIDOS

             Como ya hemos dicho anteriormente, cuando mezclamos el aceite con Sudán III, aparece todo teñido de rojo pero sin embargo, cuando lo mezclamos con la tinta china el aceite se irá hacia arriba y la tinta china se depositará en el fondo ya que a diferencia del Sudán III, no es soluble en grasas y se encontraran por tanto separados el aceite y la tinta, en una disolución heterogénea.